隨著城市化的發(fā)展，來自交通、工業(yè)、資源開采、建筑和娛樂活動的噪音污染在時間和空間上不斷擴大，陸地和水中的人為噪聲增加，對人類和野生動物的健康造成了越來越多的不良影響。有研究表明，長期暴露于人為噪聲會對魚類物種造成包括生存能力下降、生長受損、生理壓力等方面的的負面影響。基于目前快速變化的水下聲音景觀，研究不同的噪聲狀況如何影響魚類的發(fā)育、生理和行為至關(guān)重要。本文測試了暴露于不斷增加的和不同時間模式下的噪音對斑馬魚幼魚發(fā)育、生理壓力和行為模式的影響，以探究噪音如何影響動物的個體發(fā)育情況。
實驗方法
本研究通過測量暴露于不同噪聲水平和時間模式變化的實驗組之間，斑馬魚孵化率、總長度、死亡率、心率、皮質(zhì)醇水平等實驗數(shù)據(jù)，來研究噪聲對斑馬魚幼魚的發(fā)育、生理壓力和行為模式的影響。
實驗對象
在斑馬魚受精后2小時，從2至6個繁殖箱（每個箱包含約10只雌性和5只雄性）收集魚卵。將收集的卵混合在含有胚胎培養(yǎng)基的單個培養(yǎng)皿中，并分配到不同組，每組50個樣本，共分為3-5組，每組被分配到不同的聲學實驗箱。
實驗設(shè)計
為了測試振幅對斑馬魚幼魚的影響，研究使用兩個不同振幅或聲壓級（SPL）的連續(xù)白噪聲（CN）聲音文件，即130 dB（CN130）和150 dB（CN150），這些噪聲水平與淡水水生環(huán)境中的人為噪聲相似，用來模擬人為水中噪音。
為了評估不同噪聲時間機制的影響，生成了三個額外的間歇噪聲和60分鐘持續(xù)噪聲（圖1）。三個額外的間歇噪聲為：IN1-持續(xù)時間為5-12 s的短噪聲段，間隔為1-120 s的無聲間隔（每小時60次噪聲事件），達到約15%的總噪聲暴露；IN2-30-60秒的中等噪聲段，間隔1-10分鐘的靜默，每小時15個噪聲段，總體噪聲暴露與IN1相似；和IN3-15分鐘的長噪聲段，間隔15分鐘的靜默期（約占總噪聲的50%）。測試所用聲音通過軟件將聲音調(diào)整為相對平坦的頻譜，放置于聲學實驗箱中的水下?lián)P聲器進行播放。
實驗數(shù)據(jù)采集
上午10點至11點，檢查受精后48小時胚胎存活率。兩個發(fā)育階段，即受精后3天和受精后5 天，在每天早晨固定時間收集斑馬魚形態(tài)學和生理學數(shù)據(jù)。
圖1
斑馬魚測量指標
（1）形態(tài)學和心率測量。在每個實驗中，評估聲學處理對斑馬魚幼體形態(tài)發(fā)育和心率的影響。本研究使用Noldus 斑馬魚微視行為分析系統(tǒng)對斑馬魚進行形態(tài)學分析及自動檢測心臟活動。
斑馬魚微視行為分析系統(tǒng)（DanioScope）是用于評估和分析斑馬魚胚胎及幼魚活動的專業(yè)軟件。該系統(tǒng)可以通過視頻文件和靜態(tài)圖像測量斑馬魚胚胎及幼魚胎動、心跳、血液（和腸道）流動、形態(tài)學特征等多種實驗數(shù)據(jù)。并且，系統(tǒng)支持高通量的斑馬魚測試，可以節(jié)省實驗準備、獲取數(shù)據(jù)和分析結(jié)果的大量時間，提升研究效率。
（2）卵黃囊&皮質(zhì)醇測量。分析基于兩個不同發(fā)育階段的斑馬魚幼魚，以測試噪聲水平增加和不同噪聲時間模式對卵黃囊和皮質(zhì)醇生理指標的影響。
（3）光/暗選擇測量。用于評估斑馬魚幼體的環(huán)境壓力，通過在光亮側(cè)花費的時間百分比的增加反映了該模型生物體的焦慮情況。
（4）行為模式。本研究會對斑馬魚幼體進行自發(fā)交替行為（SAB）測試，該行為指動物在環(huán)境下連續(xù)轉(zhuǎn)彎過程中交替轉(zhuǎn)彎方向的趨勢，用來探究噪音對斑馬魚行為模式的影響。
實驗結(jié)果
孵化、生長和死亡率
本研究中使用的噪聲對斑馬魚胚胎的孵化率沒有顯著影響，也沒有引起明顯的胚胎發(fā)育異常。此外，噪聲水平和時間模式的變化不會影響測得的斑馬魚的總長度。但是，在連續(xù)噪聲（CN）下，觀察到CN150噪聲暴露導致斑馬魚死亡率顯著增加（圖2，C）。噪聲時間的變化也導致所有噪聲暴露組的死亡率增加（圖2，D）。間歇性的短噪音（IN1）和中噪音（IN2）周期導致較高死亡率，而呈現(xiàn)長噪音段（IN3）的治療與對照組相比未導致顯著死亡率（圖2，D）。
圖2
生理應(yīng)激指標。心率、卵黃囊消耗和皮質(zhì)醇水平隨著噪聲水平的增加而顯著增加，這清楚地表明斑馬魚較高的生理應(yīng)激。對照組幼魚在受精后3天時的心率約為173±30 bpm，在播放CN150后增加到191±60 bpm。而在受精后5天時，心率約為203±40（對照組），在CN150處理后增加到224±50 bpm。在受精后3天和5天幼魚中，隨著噪聲水平的增加，證實了心率的顯著的增加，與對照相比，CN150引起的差異最大（圖3，A）。
同樣，在受精后3天和5天幼魚中，與對照組相比，隨著噪聲水平的增加，卵黃囊消耗量顯著增加（圖3，B）。噪音干擾時間的變化對心率和卵黃囊消耗產(chǎn)生影響，表明噪聲時間機制對于調(diào)節(jié)生理應(yīng)激和胚胎內(nèi)源性能量儲備的消耗非常重要。
在受精后3天和受精后5天，心率受噪聲時間變化的顯著影響，與受精后5天的間歇性噪音相比，連續(xù)噪聲造成的影響最大（圖3，C）。此外，這些噪聲處理之間的卵黃囊消耗量存在顯著差異（圖3，D）。總體而言，心率與卵黃囊大小呈負相關(guān)，這意味著心率較高的個體消耗能量儲備更快（圖3，E）。
通過皮質(zhì)醇測量證實了噪聲誘導的生理應(yīng)激，皮質(zhì)醇水平隨著噪聲振幅的增加而顯著升高（圖4），噪聲時間機制的變化導致皮質(zhì)醇的變化。
圖3
圖4
行為模式。為了評估行為水平的潛在變化，使用焦慮相關(guān)的光/暗選擇測試（圖5，A），進一步測試了暴露于150dB連續(xù)噪聲（CN150）受精后5天的幼魚。根據(jù)測量，暴露于噪音的樣本表現(xiàn)出較強的避暗或暗視癥（圖5，B）。同時，使用自發(fā)交替行為（SAB）實驗（圖6，A）測試了斑馬魚幼魚的探索行為。結(jié)果顯示，在無聲控制條件下飼養(yǎng)的70%的幼魚表現(xiàn)出正常的游泳交替，而噪聲處理組（CN150）僅為34%（圖6，B）。在曠場中進一步研究了這些樣本的游泳模式，發(fā)現(xiàn)噪聲處理過的幼魚的覆蓋面積減少。
圖5
圖6
討論
本文測試了不斷增加的噪聲程度和不同的噪音時間機制對斑馬魚幼魚的影響。研究結(jié)果顯示：
1. 噪聲不影響一般斑馬魚胚胎的發(fā)育或孵化，但較高的噪聲水平會導致死亡率增加；
2. 在受精后3天和5天，斑馬魚心率、卵黃囊消耗量和皮質(zhì)醇水平隨著噪聲水平的增加而顯著增加；
3. 噪聲時間模式的變化表明，噪音持續(xù)的機制比噪聲暴露的總時間更重要；
4. 暴露于連續(xù)性高噪聲的斑馬魚幼魚在焦慮相關(guān)的明/暗選擇測試中表現(xiàn)出更高的暗回避能力，并且自發(fā)交替行為受損；
本文通過研究噪音對水生生態(tài)系統(tǒng)中斑馬魚幼魚的發(fā)育、生理壓力和行為模式等的影響，強調(diào)了對噪音管理的重要性。
參考文獻
Lara R A, Vasconcelos R O. Impact of noise on development, physiological stress and behavioural patterns in larval zebrafish. Scientific Reports, 2021, 11(1): 1-14.
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